ChAdOx1 interactúa con CAR y PF4 con implicaciones para la trombosis con síndrome de trombocitopenia
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abl8213
AVANCES DE LA CIENCIA•1 de diciembre de 2021•Vol 7 , número 49•DOI: 10.1126 / sciadv.abl8213
Abstracto
Las vacunas derivadas del adenovirus de chimpancé Y25 (ChAdOx1), el adenovirus humano tipo 26 (HAdV-D26) y el adenovirus humano tipo 5 (HAdV-C5) son fundamentales para combatir la pandemia aguda grave del coronavirus respiratorio 2 (SARS-CoV-2). Como parte de la campaña de vacunación más grande de la historia, se han observado efectos secundarios ultrararos que no se observaron en los ensayos de fase 3, incluida la trombosis con síndrome de trombocitopenia (STT), una afección poco común que se asemeja a la trombocitopenia inducida por heparina (TIH). Este estudio demuestra que los tres adenovirus desplegados como vectores de vacunación frente al SARS-CoV-2 se unen al factor plaquetario 4 (PF4), una proteína implicada en la patogénesis de la HIT. Hemos determinado la estructura del vector viral ChAdOx1 y lo hemos utilizado en simulaciones computacionales de última generación para demostrar un mecanismo de interacción electrostática con PF4, que fue confirmado experimentalmente por resonancia de plasmón de superficie. Estos datos confirman que PF4 es capaz de formar complejos estables con adenovirus clínicamente relevantes, un paso importante para desentrañar los mecanismos subyacentes al TTS.
INTRODUCCIÓN
El vector viral ChAdOx1, adaptado del adenovirus de chimpancé Y25 (ChAd-Y25), es la base de la vacuna ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222 / Vaxzevria) ( 1 ). ChAdOx1 nCoV-19 induce una sólida inmunidad contra el coronavirus respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2), protegiendo contra los síntomas graves que requieren hospitalización, en el 100% de los receptores de ensayos clínicos, y la infección de cualquier gravedad, en aproximadamente el 70% ( 2 , 3 ). Se ha observado un trastorno de la coagulación potencialmente mortal, la trombosis con síndrome de trombocitopenia (STT), que se presenta de manera similar a la trombocitopenia inducida por heparina (TIH) en una minoría de receptores de AZD1222 después de la primera pero no la segunda dosis ( 4 - 6). Se han realizado observaciones similares en receptores de la vacuna Janssen HAdV-D26.COV2.S, derivada del adenovirus humano tipo 26 de la especie D (HAdV-D26) ( 5 , 7 ). Se desconoce el mecanismo patológico que sustenta el STT, aunque informes recientes destacan un papel probable del factor plaquetario 4 (PF4) ( 8 , 9 ).
El conocimiento mecanicista detallado de las interacciones virus / huésped de los vectores derivados de adenovirus ha facilitado su avance a la clínica. Trabajos anteriores han demostrado que la presencia de anticuerpos neutralizantes preexistentes dirigidos a un vector adenoviral puede limitar la eficacia terapéutica, neutralizando el vector antes de que tenga un efecto terapéutico ( 10 , 11 ). Tras la administración intravenosa de adenovirus humano tipo 5 (HAdV-C5), los estudios revelaron importantes interacciones in vivo, incluidas interacciones de alta afinidad con el factor de coagulación X (FX) y / o plaquetas. Estas interacciones contribuyen a la degradación del vector y, en consecuencia, a la reducción de índice terapéutico ( 12 - 14). En conjunto, este conocimiento llevó al campo a desarrollar vectores adenovirales con baja seroprevalencia, incluidos ChAdOx1 y HAdV-D26, y la ingeniería de proteínas de la cápside para superar estos problemas ( 15 ).
Es fundamental investigar las interacciones vector-huésped de ChAdOx1 para determinar cómo puede contribuir a eventos adversos raros como TTS. Aquí, caracterizamos la estructura de la cápside de ChAdOx1 y la proteína del botón de fibra de unión al receptor primario. Usamos esta información estructural para investigar su capacidad para interactuar con socios potenciales, incluidos CD46, coxsackie y receptor de adenovirus (CAR) y PF4. Confirmamos nuestras observaciones in vitro mediante experimentos basados en células y resonancia de plasmón de superficie (SPR). Estos datos aclaran nuestra comprensión de si ChAdOx1 interactúa con las proteínas del huésped que se cree que están involucradas en la inmunogenicidad, HIT y TTS.
RESULTADOS
La estructura de la cápside viral ChAdOx1 / ChAd-Y25
Determinado a una resolución de 3,07 Å, ChAdOx1 tiene la estructura de la cápside de adenovirus icosaédrica por excelencia ( Fig. 1A ). Como en otras estructuras de adenovirus resueltas por microscopía crioelectrónica de una sola partícula (crio-EM), la resolución local es mayor en el interior más ordenado de la cápside, mientras que los componentes flexibles en el exterior de la cápside dan como resultado una señal menos resuelta (fig. S1 ). La unidad asimétrica contiene el monómero pentónico esperado; un trímero hexón peripentonal, dos secundarios y uno terciario; una copia peripentonal y una secundaria de Proteína VIII; y densidad parcial para la proteína pIIIa ( Fig. 1, B y C ).
La proteína pentámera pentamérica, ubicada en los 12 vértices icosaédricos quíntuples, tenía una señal más débil ( Fig.1, B y C ), lo que podría indicar una proteína menos ordenada o de interacción menos estable que las observadas en estructuras crio-EM previas. de HAdV-D26 y HAdV-C5. Como en otras estructuras reportadas, el bucle de pentona RGD (residuos 305 a 335), que es responsable de la unión a las integrinas luego de la unión a la superficie celular a través de la proteína del botón de fibra, se dejó sin modelar debido a la falta de señal, lo que indica su flexibilidad. .
pVIII ( Fig. 1C ) se resolvió bien, salvo los residuos 103 a 163, para los cuales no observamos señal ( Fig. 1E ), en línea con las observaciones de otros grupos ( 16 , 17 ). Se observó densidad parcial para pIIIa, concentrada cerca de la base de la pentona ( Fig. 1C ). Observamos densidades parciales para 12 copias de pVI en la base de los hexones que adoptaron dos conformaciones, ya sea envolviendo el interior del hexón antes de extenderse hacia el núcleo de la cápside o extendiéndose directamente fuera de la base del hexón para envolver la parte superior de pVIII ( Figura 1C ). Hexon se resolvió bien, incluidas las regiones hipervariables (HVR) en el exterior ( Fig. 1C), lo que permite una reconstrucción completa. La reconstrucción del modelo atómico de cápside completa da como resultado choques mínimos entre unidades asimétricas y reconstruye una cápside icosaédrica completa ( Fig. 1D ). La proteína de fibra trimérica, que consiste en un eje largo y flexible que termina en el dominio de la protuberancia globular, no se modeló ya que solo eran visibles algunas porciones mal resueltas del eje, probablemente debido a su flexibilidad (fig. S1). En cambio, el botón de fibra se resolvió mediante cristalografía.
CAR es un receptor de perilla de fibra ChAdOx1 de alta afinidad
El botón de fibra de adenovirus es responsable de la interacción principal entre el virus y la célula durante la infección. Para investigar los receptores primarios de ChAdOx1, resolvimos la estructura del receptor de botón de fibra ChAdOx1 ( Fig. 2A ). Los datos de un cristal se utilizaron para el análisis de la estructura final (fig. S2A), que muestra la simetría P1 con las dimensiones de la celda: a = 98,427 Å, b = 112,26 Å, c = 98,605 Å y β = 92,6 °. Los datos de difracción se escalaron y combinaron a una resolución de 1,59 Å. La perilla de fibra muestra los tres monómeros esperados ensamblando en un homotrímero con simetría triple ( Fig. 2A), empaquetado en una unidad asimétrica que contiene cuatro copias triméricas (fig. S2B). El mapa de densidad de electrones fue de calidad suficiente para determinar las conformaciones de las cadenas laterales en la mayor parte de la estructura (fig. S2, C y D).
Figura 2 . ChAdOx1 y HAdV-C5 tienen una estrecha homología y forman contactos CAR.
La estructura cristalográfica del botón de fibra ChAdOx1 (cian) muestra el homotrímero arquetípico ( A ) y se alinea estrechamente con el botón de fibra HAdV-C5 (naranja) con un RMSD de 1,4 Å ( B ) pero no se alinea estrechamente con el HAdV-B35 perilla de fibra [violeta ( C )]. Los modelos de homología equilibrados por dinámica molecular muestran ChAdOx1 ( D ), y los botones de fibra HAdV-C5 ( E ) forman numerosos contactos polares (rayas rojas) con CAR (cinta blanca), aunque HAdV-B35 ( F ) forma pocos. Los cálculos de energía libre en Rosetta muestran que HAdV-C5 forma la interacción predicha más fuerte con CAR, seguida de ChAdOx1 y luego HAdV-B35 ( G). El mapeo de los residuos de contacto predichos (resaltado en azul) en HAdV-C5 y ChAdOx1 con las secuencias alineadas con clustalω muestra que se conservan residuos de contacto similares en HAdV-D26 ( H ). **** P <0,001. REU, Unidades de Energía Rosetta.
La superposición de la estructura informada anteriormente de la perilla de fibra HAdV-C5 y nuestra estructura de la proteína de la perilla de fibra ChAdOx1 muestra que la homología de pliegues es alta, a pesar de que solo el 64,86% de homología de secuencia de aminoácidos, incluso en los bucles, con una desviación de la raíz cuadrada media de 1,4 Å ( figura 2B ). Existe una homología mucho menor entre el botón de fibra ChAdOx1 y HAdV-B35. El pliegue central es similar, pero los bucles son divergentes ( Fig. 2C ).
Usando la estructura de la perilla de fibra HAdV-D37 en complejo con CAR como plantilla, generamos modelos de ChAdOx1, HAdV-C5 (un adenovirus que interactúa con CAR) y HAdV-B35 (un adenovirus que interactúa con CD46, que no se une CAR) perillas de fibra, en complejo con CAR (fig. S3, A a C). Se predijo que tanto ChAdOx1 como HAdV-C5 formarían numerosos contactos polares con CAR ( Fig. 2, D y E ), y HAdV-B35 formando muy pocos ( Fig. 2F ). Los cálculos de energía de la interfaz de Rosetta respaldaron estas observaciones, lo que sugiere que la interacción CAR más fuerte fue formada por HAdV-C5, seguida por ChAdOx1, y luego por el botón de fibra HAdV-B35 ( Fig. 2G ). Estos cálculos están en línea con observaciones anteriores ( 18). El mapeo de los residuos que interactúan de nuevo con la secuencia de ChAdOx1 muestra que varios residuos de unión a CAR previstos se comparten con los botones de fibra HAdV-D26 y HAdV-C5 ( Fig. 2H ).
Para validar estas interacciones CAR predichas, realizamos SPR de proteínas de perilla de fibra ChAdOx1, HAdV-C5 y HAdV-B35 que se unen a CAR o CD46. Esto confirmó que los botones de fibra HAdV-C5 y ChAdOx1 se unen fuertemente a CAR pero no a CD46. HAdV-B35 se une fuertemente a CD46. HAdV-C5 sigue siendo el adenovirus de unión a CAR más fuerte conocido con una constante de unión de equilibrio ( K D ) de 0,06 nM, con la unión de ChAdOx1 a 7,16 nM, no tan fuerte como HAdV-C5 debido a una tasa de activación más lenta ( K a ). Estos resultados se resumen en la Fig. 3A . Las trazas de SPR están en la fig. S4 (A a C). Evaluamos si estos tres nudos de fibra se unen a CD46 y desmogleína 2 (DSG2). ChAdOx1 formó una interacción débil con CD46 con muy rápido encendido ( k a ) y apagado (k d ) cinética (fig. S4E). Observamos una interacción débil entre HAdV-B35 y CAR, probablemente indicativa de interacciones incidentales inespecíficas (fig. S4F).
Figura 3 . La perilla de fibra ChAdOx1 se une a CAR como un receptor de alta afinidad.
Los experimentos de SPR demostraron que HAdV-C5 y ChAdOx1 forman interacciones de alta afinidad con CAR, y HAdV-B35 forma interacciones de alta afinidad con CD46 ( A ). Los experimentos de inhibición de anticuerpos en células CHO-CAR ( B ) y (que expresan la isoforma CD46-BC1) CHO-BC1 ( C ) muestran que HAdV-C5 (naranja) y ChAdOx1 (cian) se unen a CAR con alta afinidad pero no a CD46, mientras que HAdV-B35 (violeta) se une a CAR con una afinidad muy débil y CD46 con alta afinidad ( D ).
Validamos estos hallazgos en un contexto celular usando ensayos de inhibición de anticuerpos en células CHO (ovario de hámster chino) -CAR, que expresan CAR pero son negativas para otros receptores de adenovirus primarios conocidos. HAdV-C5 mostró que la afinidad de unión a CAR más fuerte [concentración inhibitoria media más baja (IC 50 )] seguida de ChAdOx1.HAdV-B35 demostró una afinidad de unión a CAR débil (IC 50 > 1000 × mayor) ( Fig. 3B). Es posible que concentraciones muy altas de proteína de botón de fibra HAdV-B35 den una señal falsa a través de interacciones CAR inespecíficas tanto en este como en los experimentos SPR. Un análisis similar en células CHO-BC1, que expresan la isoforma CD46-BC1 pero ningún otro receptor de adenovirus primario conocido, determinó que HAdV-B35, tenía una fuerte interacción CD46, mientras que los botones de fibra HAdV-C5 y ChAdOx1 no tenían una capacidad medible para prevenir anti Unión del anticuerpo -CD46 ( Fig. 3C ). Estos experimentos, resumidos en la Fig. 3D , son una evidencia sólida de que ChAdOx1 usa CAR como receptor primario, no CD46 o DSG2.
La complementariedad de carga facilita un complejo ChAdOx1 con PF4
Informes recientes indican que ChAdOx1 puede interactuar con PF4, que está involucrado en HIT que tiene una presentación clínica similar a TTS ( 8 ). Usamos SPR para investigar si PF4 puede interactuar con preparaciones altamente puras de vectores de vacunas derivados de adenovirus Ad26, Ad5 y ChAdOx1 o con la preparación de vacunas de ChAdOx1 y AZD1222. Se observó que ChAdOx1, Ad5 y Ad26 se unían a PF4 con afinidades de 661, 789 y 301 nM, respectivamente ( Fig. 4 ). Se observó que AZD1222 tenía una afinidad por el PF4 similar a la del virus purificado, con una afinidad de 514 nM (figura S5).
Figura 4 . Los adenovirus clínicos se unen a PF4 con afinidad nanomolar.
Los experimentos de SPR de inyección única muestran que ChAdOx1 ( A ), HAdV-C5 ( B ) y HAdV-D26 ( C ) forman interacciones estables y reproducibles con PF4. La afinidad se calculó utilizando el modelo de estado estable ( D ), y la curva mostró un ajuste cercano a las concentraciones probadas (recuadros).
La especificidad de la unión de PF4 se confirmó mediante la unión del anticuerpo anti-PF4 al complejo ChAdOx1 / PF4 en el chip ( Fig. 5A ). Esto demuestra la capacidad de los anticuerpos para unirse a PF4 mientras permanece en complejo con ChAdOx1. Repetimos los experimentos de SPR usando diferentes concentraciones de sal y observamos una unión de PF4 reducida con un aumento de sal, lo que sugiere una interacción electrostática ( Fig. 5B ).
Los cálculos de potencial de superficie electrostático continuo muestran que la cápside de ChAdOx1 tiene un potencial de superficie electronegativo de <−1.5 k B T (constante de Boltzmann) en aproximadamente el 90% de su superficie, interrumpido en espacios interhexónicos ocupados por pIX, donde el potencial de superficie se eleva a> −0,5 k B T ( Fig. 5C y Fig. S6A). Comparamos el potencial de superficie con el de HAdV-D26, que también está implicado en TTS. HAdV-D26 tiene un potencial de superficie electronegativo en general, pero menos fuerte que ChAdOx1 a <-1,0 k B T . A diferencia de ChAdOx1, observamos regiones de potencial positivo, hasta> +1,5 k B T, empotrado en los espacios entre hexágonos ( Fig. 5D y Fig. S6B).
En ambos virus, el potencial positivo es impulsado por las regiones apicales de la proteína de la cápside principal del adenovirus, hexon, que calculamos como más negativa en ChAdOx1, seguida de HAdV-C5 y luego HAdV-D26 (fig. S6C). También observamos que PF4 tiene un fuerte potencial superficial electropositivo (fig. S6D). Estas observaciones son consistentes con un mecanismo electrostático de interacción entre ChAdOx1 y PF4.
PF4 se une a ChAdOx1 en el espacio interhexónico
Para investigar un posible mecanismo de unión, realizamos simulaciones de dinámica browniana (BD) de PF4 con la estructura de la cápside ChAdOx1 o HAdV-D26. Los resultados muestran que el PF4 que se difunde libremente con frecuencia contacta con la superficie de la cápside de ChAdOx1 entre los hexones, más comúnmente en las interfaces de tres hexones donde se concentra la carga negativa y se maximiza el espacio entre hexones ( Fig. 6A ). HAdV-D26 también forma contactos con PF4 pero con menos frecuencia ( Fig. 6B ). Estas simulaciones representan que los posibles eventos de iniciación de la unión no deben usarse para interpretar la afinidad relativa de las interacciones.
Figura 6 . PF4 se une a ChAdOx1 en los espacios interhexónicos con más frecuencia que a Ad26.
Las simulaciones de BD de PF4 en solución con la faceta muestran las ubicaciones en las que PF4 hace contacto con la faceta (puntos rojos) de ChAdOx1 ( A ) y Ad26 ( B ), mostrando que el lugar de interacción más común es el espacio entre tres hexones, donde Se observa que el PF4 (violeta) se hunde en el espacio entre hexones exponiendo regiones electropositivas a los hexones electronegativos ( C ). El análisis de los eventos de unión a PF4 muestra que PF4 siempre forma contactos con ChAdOx1 orientado con su eje más largo más normal al plano del hexón ( D ). Ciertos residuos de hexones están involucrados más comúnmente en la interacción PF4 ( E), los residuos rojos interactúan> 50% del tiempo, los residuos magenta interactúan> 20% y los residuos azules interactúan 20-1%. Todos estos residuos están dentro de los bucles HVR (dibujo verde). Estos residuos están subrayados en la alineación de secuencia con Ad26 y Ad5 contenida en los recuadros verdes que indican las secuencias de HVR ( F ). El color del mapa de carga es el mismo que en la Fig.5 .
El análisis de un evento de unión de ChAdOx1 / PF4 ejemplar en la interfaz del hexón triple muestra las caras electropositivas de PF4, que ocurren a lo largo de su eje más largo, orientadas para enfrentar el potencial electronegativo de los hexones circundantes ( Fig. 6C ). Para evaluar si esta orientación era un requisito para la unión, realizamos un análisis de agrupamiento de los contactos en nuestra simulación. El análisis indica que PF4 está orientado de manera similar al ejemplo de la Fig. 6C en todos los casos de contacto ( Fig. 6D ). Esta pose de unión común apoya la idea de que la interacción ChAdOx1 / PF4 tiene determinantes específicos.
Para identificar los aminoácidos que son potencialmente importantes para la interacción ChAdOx1 / PF4, calculamos la frecuencia de contactos entre PF4 y los hexones de ChAdOx1 en simulaciones de BD. Estos indican residuos de contactos de PF4 en los HVR de ChAdOx1 ( Fig. 6, E y F ). Los HVR miran hacia el espacio entre los hexones y son muy flexibles, creando un volumen fluctuante en el espacio entre hexones (fig. S7, A y B).
La heparina inhibe la formación del complejo ChAdOx1 / PF4
La heparina también es un componente clave en el mecanismo de HIT, se une a múltiples copias de PF4 y forma agregados con anticuerpos anti-PF4 que estimulan la activación plaquetaria a través del receptor Fcγ IIa (RIIa). Realizamos experimentos SPR y BD para probar qué efecto tiene la unión de heparina a PF4 sobre la capacidad de PF4 para unirse a ChAdOx1. En experimentos de BD, observamos que PF4 en complejo con fondaparinux, un fármaco anticoagulante compuesto por pentasacárido de heparina que se une a PF4, redujo significativamente el número de eventos de inicio de unión con la superficie de la cápside ChAdOx1 (fig. S8, A a C). En ChAdOx1 purificado y la preparación de la vacuna AZD1222, observamos que la unión de PF4 a ChAdOx1 se inhibía fuertemente por la preincubación con heparina ( Fig. 7Ay fig. S8D). Los cálculos electrostáticos continuos de PF4 y PF4 en complejo con fondaparinux muestran que el potencial electronegativo de PF4 se elimina en presencia de fondaparinux ( Fig. 7, B y C ). Inferimos que este potencial electropositivo debilitado puede reducir la capacidad de PF4 para formar una asociación electrostática con ChAdOx1.
Figura 7 . El complejo ChAdOx1 / PF4 es inhibido por la presencia de heparina.
SPR mostró que la preincubación de PF4 con heparina inhibe la capacidad de PF4 para unirse a ChAdOx1 ( A ). Los cálculos muestran que la carga altamente electropositiva en PF4 [púrpura ( B )] se interrumpe en presencia de heparina, como lo muestra el aumento en el potencial electronegativo cuando el PF4 forma un complejo con fondaparinux, un pentasacárido derivado de la heparina ( C ). El color del mapa de carga es el mismo que en la Fig.5 .
DISCUSIÓN
Hemos resuelto la estructura de la cápside del vector de la vacuna viral ChAdOx1 a una resolución de 3,07 Å, la resolución más alta informada de una cápside de adenovirus hasta la fecha. Hemos caracterizado su proteína de unión celular primaria, el botón de fibra ( Figs. 1 y 2 ), y demostramos que ChAdOx1, un adenovirus de simio, comparte una homología estructural considerable con los adenovirus humanos. Utilizamos nuestra comprensión estructural y modelos computacionales para predecir las interacciones entre ChAdOx1 y las proteínas del huésped. CAR está implicado en la transducción de las células huésped y es probable que sea importante para la función de la vacuna. El otro, PF4, contribuye a la patogénesis en HIT y se presume que está involucrado en TTS.
Confirmamos que CAR es un receptor de alta afinidad para la proteína del botón de fibra ChAdOx1 ( Figs. 2 y 3 ). Dada la capacidad establecida de ChAdOx1 para infectar células humanas y de chimpancé, se deduce que utiliza un receptor que se conserva entre estas especies. CAR es un ejemplo de esto, ya que las proteínas CAR humanas y de chimpancé tienen secuencias de aminoácidos idénticas (fig. S9) ( 1 ). Este es un ejemplo verificado de adenovirus humanos y de primates que comparten una proteína receptora de adenovirus común, aunque la utilización cruzada de CAR se ha observado anteriormente, ya que los adenovirus humanos y caninos usan CAR como receptor de entrada celular de alta afinidad ( 19 , 20 ).
Demostramos que la perilla de fibra ChAdOx1 no se une a CD46 o DSG2 ( Fig. 3 y Fig. S4). Sin embargo, esto no excluye receptores adicionales. Por ejemplo, las proteínas de perilla de fibra HAdV-D37 y HAdV-D26 se unen tanto a CAR como a glucanos portadores de ácido siálico ( 21 , 22 ). Posiblemente, podría haber otros mecanismos de interacción directa entre la superficie de la célula y la cápside, como la interacción hexón-CD46, sugerida recientemente para HAdV-D56, aunque no está claro si esta interacción putativa sería suficiente para una infección productiva in vivo ( 23 ).
El CAR, qones se ven facilitadas por la complementariedad electrostática entre el PF4 electropositivo y la cápside ChAdOx1 electronegativa, emparejada con una complementariedad de forma que permite a PF4 entrar en el espacio entre hexones ( Figs. 6 y 7 y Fig. S6). La naturaleza electrostática de esta interacción fue apoyada adicionalmente por experimentos SPR en presencia de concentraciones crecientes de sal ( Fig. 5B ). Los contactos de aminoácidos son más frecuentes en los bucles HVR ( Fig.7, E y F). Actualmente, no está claro si los contactos representan una interacción de aminoácidos específica o son una función de los HVR flexibles que entran en el espacio interhexónico donde PF4 se une más comúnmente (fig. S7).
Ad26 también se ha implicado en TTS con una frecuencia similar a ChAdOx1 por dosis ( 7 , 32 ). Utilizando un modelo previamente publicado de Ad26 ( 16 ), realizamos simulaciones como para ChAdOx1 y observamos que PF4 contactaba con Ad26 con menos frecuencia que ChAdOx1 ( Fig. 6, A y B ). Sin embargo, es importante reconocer que BD no tiene en cuenta la flexibilidad de las proteínas después de la interacción inicial y opera en una escala de tiempo acelerada. Por lo tanto, no se pueden hacer inferencias con respecto a los tiempos de residencia de la proteína y si se forma un complejo estable. Esto debería explorarse en futuras simulaciones de dinámica molecular.
La evidencia actual indica que el TTS se presenta de manera similar a la HIT, una condición en la que los pacientes presentan coágulos de sangre después de la administración del fármaco tromboprofiláctico, heparina ( 33). Esta condición parece estar impulsada por autoanticuerpos anti-PF4 de suficiente afinidad para agrupar PF4 y crear una interacción multivalente, presumiblemente de mayor avidez, entre los dominios Fc del anticuerpo y FcγRIIa en la superficie plaquetaria, estimulando la plaqueta para liberar PF4 adicional. En el contexto de la heparina, el PF4 sufre un cambio conformacional, lo que facilita la unión de anticuerpos más comunes de menor afinidad específicos del complejo PF4-polianión. Esto crea un ciclo de retroalimentación positiva a medida que los anticuerpos se unen a copias crecientes de PF4, estimulando una mayor activación plaquetaria, culminando con la activación de la cascada de coagulación. Este mecanismo se describe en detalle por Nguyen et al. ( 34). Para resumir adicionalmente, si los autoanticuerpos anti-PF4 inducen trombosis, o no, es una función de la concentración y la afinidad del anticuerpo por PF4.
Los informes de casos recientes muestran que la mayoría de los pacientes que presentan TTS (> 90%) dieron positivo en anticuerpos αPF4; sin embargo, la historia clínica incompleta limita la comprensión de los factores predisponentes ( 4 ). A diferencia de los observados en HIT, los anticuerpos anti-PF4 observados en pacientes con TTS eran predominantemente del subgrupo que podía unirse a PF4 solo, en lugar del complejo PF4-heparina ( 31 ).
Un complejo ChAdOx1 / PF4 podría inducir autoanticuerpos anti-PF4. En este mecanismo potencial, pequeñas cantidades de ChAdOx1 ingresan a la sangre a través de lesiones capilares menores causadas por la inyección intramuscular, como se ha observado anteriormente ( 35 ). Entonces podría formarse un complejo ChAdOx1 / PF4 ( Figs. 5 a 7 ), ya sea de forma independiente o en asociación con plaquetas ( 36 ), y viajar al sistema linfático, transportado por monocitos. Alternativamente, el PF4 liberado en el lugar de la inyección puede formar complejos con el vector y drenar directamente al sistema linfático. Estos complejos virus / PF4 pueden estimular a las células B de memoria anti-PF4 preexistentes para que se diferencien en células plasmáticas, secretando anticuerpos anti-PF4, lo que generalmente toma de 4 a 8 días ( 37). Esta hipótesis se resume en la fig. S10. Es notable que el STT se observa con mucha menos frecuencia después de la segunda dosis de ChAdOx1, lo que sugiere que, como en la HIT, la inmunoglobulina G αPF4 no es de larga duración y que cualquier mecanismo plausible debería ser prominente en la primera pero no en la segunda dosis ( 6 , 38).). Se necesitan estudios para confirmar si los complejos adenovirus / PF4 pueden inducir trombosis en presencia de anticuerpos anti-PF4 in vivo. Esta propuesta explica de alguna manera por qué el STT se observa tan raramente, porque puede requerir una serie de interacciones estocásticas de baja frecuencia, primero entre pequeñas cantidades de partículas de adenovirus que ingresan a la sangre / linfa y luego monocitos y / o células B, que solo pueden ocurren en individuos que están predispuestos a la generación de anticuerpos anti-PF4.
A diferencia de una propuesta anterior, no sugerimos que el EDTA, o las proteínas HEK293 residuales, en la formulación de la vacuna contribuyan al TTS ( 8 ). El EDTA es un componente de la formulación de la vacuna ChAdOx1 nCoV-19, pero no está presente en la vacuna Ad26.SARS2.S, después de lo cual también se ha informado TTS ( 5 , 7 , 8 , 39 ). Observamos que los síntomas del STT se manifiestan de 5 a 24 días después de la vacunación, lo que corresponde a la línea de tiempo para una respuesta secundaria de anticuerpos ( 8). Si se forman complejos inmunes grandes directamente con los componentes de la formulación de la vacuna, entonces parece más probable que conduzcan a la activación plaquetaria y la formación de coágulos inmediatamente después de la vacunación, en lugar de> 5 días después. La discusión en torno a los posibles mecanismos de TTS se ha revisado recientemente ( 9 ).
La guía clínica actual de la Organización Mundial de la Salud desaconseja el uso de heparina en el tratamiento de TTS, presumiblemente basándose en la presentación clínica similar de TTS y HIT ( 40 ). Aunque nuestros datos sugieren que la heparina puede inhibir la interacción propuesta entre ChAdOx1 y PF4, no proporciona información sobre el efecto de la heparina en los pacientes después de que desarrollan síntomas o su comportamiento en el contexto biológico más amplio. Por lo tanto, es importante seguir cumpliendo las directrices clínicas actuales en espera de más estudios sobre el papel de la heparina en el ultivo se volvió amarillo, se reemplazó el medio. Una vez que el CPE se hizo evidente, pero las células no estaban listas para ser recolectadas, el medio amarillento se complementó con tampón de bicarbonato de sodio (pH 7,4, Gibco) hasta que enrojeció. Esto se hizo para retener el virus liberado en el medio. Una vez que se observó CPE en> 80% de la monocapa celular, las células (5 a 8 días después de la infección) se disociaron del matraz por golpe. El sobrenadante y las células se separaron mediante centrifugación a 300ºC.g durante 5 min, ambos se almacenaron a -80 ° C hasta que estén listos para la purificación.
Purificación de ChAdOx1
El medio que contenía ChAdOx1 se aclaró mediante centrifugacióSTT.
La interacción ChAdOx1 / PF4 descrita en este estudio sugiere posibles mecanismos mediante los cuales se podrían diseñar vectores virales más seguros mediante la ablación de esta interacción. Se han realizado "intercambios de HVR" con el objetivo de reducir el reconocimiento del vector de adenovirus mediante la neutralización de anticuerpos ( 11 , 41). Una ingeniería de cápside racional similar podría eliminar residuos electronegativos en los HVR, aunque aún no se ha determinado un umbral por debajo del cual se debe reducir la carga electronegativa. Alternativamente, al determinar los residuos de unión clave, podría contemplarse un enfoque más específico en el que se eliminen o sustituyan los aminoácidos críticos que forman contactos con PF4. Por lo tanto, la modificación de los HVR de hexón de ChAdOx1 para reducir su electronegatividad puede resolver dos problemas simultáneamente: reducir la propensión a causar TTS y reducir los niveles de inmunidad antivector, lo que ayuda a maximizar la oportunidad de inducir respuestas inmunes robustas. Una mayor exploración de la diversidad filogenética de adenovirus puede producir nuevos vectores con menor propensión a unirse a PF4 y perfiles de seguridad alterados.
Ahora, ningún mecanismo propuesto para TTS después de la vacunación es consistente con todos los datos observados. Esto se debe en parte a un cuadro clínico incompleto, una consecuencia de su rareza, datos estadísticos débiles de los que sacar inferencias y una falta de comprensión sobre esta nueva interacción. El trabajo futuro se centrará en aclarar si el complejo adenovirus / PF4 es inherentemente trombogénico y, de ser así, qué interacciones posteriores conducen a esto.
MATERIALES Y MÉTODOS
Propagación del virus ChAdOx1
Se sembraron matraces de cultivo celular T225 CellBind (10 ×; Corning) con aproximadamente 5 × 10 6riñón embrionario humano 293 (HEK-293) células T-REx (Invitrogen) cada una. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% y penicilina / estreptomicina al 1% (Gibco) hasta una confluencia del 80%. Las células se infectaron con ChAdOx1.eGFP, proporcionado por Coughlan Lab (Universidad de Maryland), con una multiplicidad de infección de 0,01. A continuación, las células se controlaron para determinar el efecto citopático (CPE). Cuando el medio de cn a 4000 rpm durante 10 min en una centrífuga de mesa. A continuación, se cargó el sobrenadante en tubos ultraclaros de 38 ml compatibles con el rotor SW28 (Beckman Coulter) y se centrifugó a 100.000 g.durante 1 hora en una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima XPN-100. Se descartó el sobrenadante y el sedimento, que era ligeramente amarillo y pegajoso, se resuspendió en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4, Gibco). Estos 5 ml de PBS que contienen ChAdOx1 del sobrenadante se utilizaron para resuspender el sedimento HEK-293 T-REx infectado. A continuación, esta solución se mezcló en una proporción de 1: 1 con tetracloroetileno (TCE; Sigma-Aldrich) y se agitó violentamente para asegurar una mezcla completa. A continuación, se centrifugó la mezcla de virus, PBS y TCE a 2000 rpm en una centrífuga de mesa durante 20 min. La capa acuosa superior de la solución se eliminó pipeteando y se colocó en un tubo nuevo. A continuación, se realizó una segunda extracción de TCE añadiendo otros 5 ml de TCE a la capa acuosa, agitando y centrifugando, como antes. Esto se realiza para asegurar la máxima eliminación de los desechos celulares. Las purificaciones anteriores que excluyeron esta segunda extracción mostraron depósitos de grasa cuando se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa y dieron como resultado una agregación viral. A continuación, la capa acuosa superior se extrajo nuevamente y el resto de la purificación se realizó utilizando el método de gradiente de CsCl de dos pasos, como se describió anteriormente (42 ), a excepción de la siguiente modificación: Durante la extracción final de la banda que contiene virus, que debe tener un aspecto blanco y crujiente, la banda no se retiró con una aguja a través del costado del tubo, sino pipeteando. Se utilizó una pipeta P1000 para retirar lentamente el líquido del tubo, extrayéndolo del menisco, con cuidado de no romper la banda. Se eliminó tanto líquido por encima de la banda como fue posible, luego se utilizó una nueva punta de pipeta para retirar la banda del menisco en el menor volumen posible.
Esta banda se cargó en un casete Slide-A-Lyzer de 0,5 ml con un MWCO (corte de peso molecular) de 100.000 (Thermo Fisher Scientific) y se dializó frente a 1 litro de tampón de congelación por inmersión [NaCl 150 mM, MgCl 2 1 mM , Tris 20 mM (pH 7,4)]. Esta solución se utilizó para preparar rejillas para crio-EM.
Preparación de la red Cryo-EM
Se descargó una rejilla UltrAuFoil (688-300-AU, Ted Pella Inc.) en un PELCO easiGlow (Ted Pella Inc.) durante 30 s. Se utilizó un congelador de inmersión automático Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) para secar y congelar las rejillas en etano líquido utilizando el siguiente protocolo: La cámara de muestra se ajustó a 25 ° C y 100% de humedad, se aplicaron 2,5 μl de muestra en ambos lados de la rejilla, y se utilizó una fuerza de transferencia de 1 y un tiempo de drenaje de 3 s para la congelación por inmersión. La rejilla congelada se transfirió a cajas criogénicas bajo nitrógeno líquido para su almacenamiento.
Recopilación de datos Cryo-EM
La muestra vitrificada eran imágenes utilizando un microscopio electrónico de transmisión FEI Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) que funcionaba a un voltaje de aceleración de 300 keV con una cámara detectora de electrones directos Gatan K2 Summit (Pleasanton, CA) con un aumento nominal de × 37,313, correspondiente a un tamaño de píxel de 1,34 Å / píxel a nivel de muestra. Un total de 2875 películas, cada una de las cuales consta de 40 fotogramas en el transcurso de 8 s, se recopilaron en modo de superresolución con un tamaño de subpíxeles de 0,67 Å por píxel. La configuración de desenfoque se cambió de -0,5 a -1,6 μm para cada exposición. La tasa de dosis se ajustó a 2,59 e - por píxel por segundo con 1,18 e - / Å 2 por fotograma de película. Los datos se registraron y empaquetaron en formato TIFF comprimido de 4 bits y LZW.
Procesamiento de imágenes Cryo-EM y determinación de estructura
Los conjuntos de datos se procesaron utilizando RELION (versión 3.1.1) ( 43) en una estación de trabajo con un procesador Intel I7-6800K de 3,4 GHz, 800 gigabytes de memoria, una unidad SSD (unidad de estado sólido) de 1 terabyte y 4 GPU (unidades de procesamiento gráfico) NVIDIA GTX 1080. Una partición de intercambio grande se estableció en 512 gigabytes. La corrección de movimiento se realizó utilizando RELION con un factor de agrupamiento de 2 y eliminando los primeros tres fotogramas. La estimación de CTF (Función de transferencia de contraste) se realizó utilizando CTFFIND (versión 4.1). Se recogieron manualmente un total de 8375 partículas. Las partículas se extrajeron con un tamaño de caja de 1440 píxeles y luego se recortaron con Fourier a 512 píxeles para la curación de partículas y la construcción del modelo inicial. Se utilizó la clasificación iterativa de imágenes bidimensionales (2D) para curar los datos, y las partículas mal alineadas se eliminaron de la pila de imágenes final. Se generó un modelo Ab initio utilizando el método de descenso de gradiente estocástico sin imponer ninguna simetría. Luego, el modelo se alineó con su origen de fase con una simetría icosaédrica utilizando el programa "relion_align_symmetry" antes de ser utilizado como mapa de referencia para la clasificación 3D. La clase 3D seleccionada fue seleccionada para un mayor refinamiento. Las imágenes de partículas refinadas se volvieron a extraer sin reescalar y se curaron usando clasificación 2D sin alineación. El modelo final se refinó contra las 5748 partículas seleccionadas, con una máscara para eliminar los píxeles dentro de la esfera interior de un radio de 285 Å. La resolución se determinó en 4,17 Å utilizando los criterios estándar de oro de corrección de Fourier Shell (FSC) ( Luego, el modelo se alineó con su origen de fase con una simetría icosaédrica utilizando el programa "relion_align_symmetry" antes de ser utilizado como mapa de referencia para la clasificación 3D. La clase 3D seleccionada fue seleccionada para un mayor refinamiento. Las imágenes de partículas refinadas se volvieron a extraer sin reescalar y se curaron usando clasificación 2D sin alineación. El modelo final se refinó contra las 5748 partículas seleccionadas, con una máscara para eliminar los píxeles dentro de la esfera interior de un radio de 285 Å. La resolución se determinó en 4,17 Å utilizando los criterios estándar de oro de corrección de Fourier Shell (FSC) ( Luego, el modelo se alineó con su origen de fase con una simetría icosaédrica utilizando el programa "relion_align_symmetry" antes de ser utilizado como mapa de referencia para la clasificación 3D. La clase 3D seleccionada fue seleccionada para un mayor refinamiento. Las imágenes de partículas refinadas se volvieron a extraer sin reescalar y se curaron usando clasificación 2D sin alineación. El modelo final se refinó contra las 5748 partículas seleccionadas, con una máscara para eliminar los píxeles dentro de la esfera interior de un radio de 285 Å. La resolución se determinó en 4,17 Å utilizando los criterios estándar de oro de corrección de Fourier Shell (FSC) ( El modelo final se refinó contra las 5748 partículas seleccionadas, con una máscara para eliminar los píxeles dentro de la esfera interior de un radio de 285 Å. La resolución se determinó en 4,17 Å utilizando los criterios estándar de oro de corrección de Fourier Shell (FSC) ( El modelo final se refinó contra las 5748 partículas seleccionadas, con una máscara para eliminar los píxeles dentro de la esfera interior de un radio de 285 Å. La resolución se determinó en 4,17 Å utilizando los criterios estándar de oro de corrección de Fourier Shell (FSC) (44 ). Las partículas se volvieron a extraer con un tamaño de caja de 1260 píxeles para reducir las limitaciones de Nyquist. El refinamiento en este tamaño de caja no se pudo ejecutar con la aceleración de la GPU debido a las limitaciones en la memoria de la tarjeta de video y, por lo tanto, se consideraron cuidadosamente los requisitos de memoria. Cada iteración de refinamiento tardó aproximadamente 3 días en completarse mientras se ejecutaba en 9 núcleos MPI (Interfaz de paso de mensajes). Las partículas experimentaron refinamiento CTF con anisotropía de aumento, lo que resultó en un mapa de 3,50 Å después del refinamiento. A esto le siguió una mayor corrección de CTF, que mejoró la resolución del mapa a aproximadamente 3,32 Å. El pulido bayesiano dio como resultado mejoras insignificantes. Por último, se corrigió la curvatura de la esfera de Ewald para producir un mapa final con una resolución promedio de 3.07 Å según lo determinado por la implementación de RELION del estándar de oro FSC (45 ) o 3,04 Å según lo determinado por la función phenix.mtriage de Phenix. El mapa resultante se afinó con DeepEMhancer utilizando modelos de entrenamiento highRes, tightTarget y wideTarget y requirió 2,5 días para ejecutarse en 4 GPU NVIDIA V100.
Construcción de modelos de cápside ChAdOx1
La secuencia de aminoácidos de las proteínas de la cápside del virus ChAdOx1 se describe en la secuencia del genoma de la fuente ChAdV-Y25 utilizada para desarrollar el vector ChAdOx1 (NC_017825.1). No hay diferencias entre ChAdOx1 e Y25 en las proteínas de la cápside.
Se utilizó el servidor web I-TASSER ( 46 ) o SWISS-MODEL ( 47 ) para construir modelos de homología de las diversas proteínas de la cápside ChAdOx1. Inicialmente, los modelos atómicos obtenidos del servidor web eran un cuerpo rígido ajustado al mapa de densidad de la cápside usando ChimeraX ( 48 ), primero por colocación manual y luego usando el algoritmo de ajuste en el mapa, comenzando con los hexones, luego el pentón, pVIII, pIX , y pIIIa, respectivamente, hasta que se haya ensamblado una unidad asimétrica completa. Después de la colocación inicial del modelo atómico dentro del mapa de densidad, el modelo se ajustó utilizando el método de ajuste flexible de dinámica molecular (MDFF) en disolvente explícito ( 49 , 50). Para evitar que los modelos atómicos se ajusten a la densidad adyacente, se agregaron modelos de proteínas adicionales que rodean la unidad asimétrica para ocupar esas regiones del mapa de densidad. Esta unidad asimétrica "tamponada" se sometió luego a otra ronda de MDFF en disolvente explícito para mejorar la calidad de ajuste al mapa de densidad teniendo en cuenta las interacciones proteína-proteína entre subunidades de proteínas. Luego se inspeccionaron los modelos y las regiones de bucle con densidad de baja resolución se modelaron manualmente utilizando ISOLDE ( 51 ). El modelo se refinó aún más utilizando MDFF restringido por simetría para abordar los choques entre unidades asimétricas y mejorar aún más los ajustes locales en el borde de la unidad asimétrica ( 52 ). Todas las simulaciones MDFF se realizaron en NAMD 2.14 ( 53 ) utilizando el CHARMM36 (54 ) campo de fuerza para proteínas, agua e iones a 300 K. El sistema inicial para cada simulación MDFF se preparó utilizando el software Visual Molecular Dynamics (VMD) 1.9.3 ( 55 ). La función de energía potencial ( U EM ), obtenida mediante la conversión del mapa de densidad EM, se aplicó a la columna vertebral de la proteína durante el ajuste flexible con unaescala g de 0,3. Durante el ajuste flexible, se aplicaron restricciones estándar para mantener la estructura secundaria, el péptido cis y la quiralidad en las estructuras de las proteínas ( 56 ). Luego, el modelo se refinó aún más utilizando ISOLDE tal como se implementó en ChimeraX. Por último, se eliminaron del modelo los residuos para los que no había señal.
Determinación de la cristalización y estructura de la proteína de perilla de fibra ChAdOx1
Producción y purificación de proteína de perilla de fibra ChAdOx1
El método utilizado para purificar la proteína del botón de fibra ChAdOx1 es idéntico al descrito anteriormente para HAdV-D26 y HAdV-D48. Para resumir, SG13009 Escherichia coli que contiene el plásmido pREP-4 se transfectó con el vector de expresión pQE-30 que contiene el transgén de perilla de fibra ChAdOx1, ubicado C-terminal al sitio de la etiqueta 6His, que consta de los 13 residuos que preceden al motivo TLW al residuo terminal . Estas E. colise seleccionaron en ampicilina (100 μg / ml) y kanamicina (50 μg / ml). Se cultivaron en 25 ml de LB con ampicilina (100 µg / ml) y kanamicina (50 µg / ml) durante la noche a partir de reservas de glicerol. Se inocularon dos litros de Terrific Broth (Terrific Broth, modificado, Sigma-Aldrich) que contenía ampicilina (100 μg / ml) y kanamicina (50 μg / ml) con el cultivo de una noche y se incubó a 37 ° C durante 4 horas hasta que alcanzó un densidad óptica (DO) de 0,6 a λ570 nm. Una vez que alcanzó la DO 0,6 , se añadió isopropil-β- D- tiogalactopiranósido a una concentración final de 0,5 mM y el cultivo se incubó durante 18 horas a 21ºC. Las células se recolectaron por centrifugación a 3000 g.durante 10 min a 4 ° C, resuspendido en tampón de lisis [tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, NP-40 al 1% (v / v), lisozima (1 mg / ml), β-mercaptoetanol 1 mM, e imidazol 10 mM], y se incubó durante 15 min con agitación a temperatura ambiente. A continuación, el lisado se centrifugó a 30.000 g.durante 20 min a 4 ° C y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm (Milipore, Abingdon, Reino Unido). El lisado filtrado se cargó luego en una columna de cromatografía de afinidad de níquel HisTrap FF de 5 ml (GE Life Science) a 2,0 ml / min y se lavó con 15 ml en tampón de elución A [Tris-HCl 50 mM o base (pH 8,0), 300 mM NaCl y β-mercaptoetanol 1 mM]. La elución se realizó usando una velocidad de gradiente de 20 min / ml del tampón B [tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, β-mercaptoetanol 1 mM e imidazol 400 mM]. Las fracciones recolectadas se concentraron por centrifugación usando una columna Vivaspin 10,000 MWCO (Sartorious, Goettingen, Alemania) y se analizaron mediante un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) teñido con azul de Coomassie (las bandas correctas son aproximadamente 25 kDa). Se realizó una segunda ronda de purificación usando una cromatografía de exclusión por tamaño GE 10/300 GL Increase Superdex 200 (GE Life Science) a 0,5 ml / min y se lavó con 50 ml de tampón Baker [NaCl 50 mM y tris 10 mM (pH 7,6) ]. A continuación, se analizaron las fracciones usando un gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie para comprobar la pureza y el peso molecular.
Condiciones de cristalización
La concentración de proteína final fue de 13,5 mg / ml. Para la cristalización, se utilizaron las pantallas de cristalización comerciales BCS y PACT Premier (Molecular Dimensions). Los cristales se cultivaron a 20 ° C en gotas que contenían una relación de proteína a licor madre de 1: 1 (v / v). Se requirió micro-siembra para un crecimiento óptimo de los cristales. El experimento de microsiembra se estableció utilizando un robot de cristalización Mosquito. Los cristales aparecieron entre 5 y 14 días.
La condición de cristalización para la estructura resuelta fue 0,1 M de cloruro de calcio dihidrato, 0,1 M de cloruro de magnesio hexahidratado, 0,1 M tubos (pH 7,0), 22,5% (v / v) de medio de frotis de PEG (polietilenglicol), 0,2 M de cloruro de calcio dihidrato, 0,1 M tris (pH 8,0) y PEG 6000 al 20% (p / v).
Determinación de estructura
Los datos de difracción se registraron en la línea de luz DIAMOND DLS-I03, utilizando GDA (Adquisición de datos genéricos) para controlar la recopilación de datos. La reducción automática de datos se completó con XDS y DIALS, y los equivalentes se escalaron y fusionaron con AIMLESS y TRUNCATE ( 57 ). El conjunto de datos único se utilizó en PHASER para resolver la estructura con reemplazo molecular, utilizando un modelo de búsqueda preparado por SWISS-MODEL sobre la base de la estructura de la proteína del botón de fibra del adenovirus C5, entrada 1KNB del Protein Data Bank (PDB) ( 58 ). Ciclos repetidos de sesiones gráficas en Coot ( 59) y el refinamiento en REFMAC5 dio como resultado el modelo final presentado en este manuscrito. Quedó claro que el conjunto de datos sufría de hermanamiento, que se determinó automáticamente en REFMAC5 como una ley de gemelos, con una fracción de ~ 0,15. Los detalles de la recopilación de datos y las estadísticas de refinamiento se incluyen en la fig. S2A. Las coordenadas finales se depositan en la AP mundial (wwPDB) como entrada 7OP2.
Modelado de interfaces CAR de perillas de fibra
La estructura preexistente del botón de fibra HAdV-D37 en complejo con CAR D1 (PDB 2J12) ( 19 ) se utilizó como plantilla para ajustar otras proteínas de botón de fibra, como se describió anteriormente. La estructura preexistente de HAdV-C5 (PDB 1KNB) ( 58 ) y HAdV-B35 (PDB 2QLK) ( 60 ) se alinearon con la perilla de fibra HAdV-D37 en PyMOL usando el comando "cealign", al igual que la estructura de perilla de fibra de ChAdOx1 ( 61 ). Se guardaron nuevos modelos que contenían las tres cadenas CAR y uno de los trimers de perilla de fibra quimérica instalados. Estos modelos de homología se sometieron a 10,000 pasos de minimización de energía utilizando un algoritmo de búsqueda de línea y gradiente conjugado nativo de NAMD ( 53) y equilibrado por una breve simulación de dinámica molecular de 2 ns. Estos modelos, vistos en la Fig. 2 (A a C) y la fig. S3, y la interacción de unión entre los tres botones de fibra y las interfaces CAR proteína-proteína se puntuó en cada cuadro de la trayectoria MD utilizando la herramienta Rosetta InterfaceAnalyzer ( 62 , 63 ).
Determinación de la relación de IC 50 valores de CAR y CD46 de unión para las proteínas de la perilla de la fibra
Los ensayos de inhibición de la unión de anticuerpos se realizaron como se describió anteriormente ( 18). Se recolectaron células CHO-CAR y CHO-BC1, y se transfirieron 40.000 células por pocillo a una placa con fondo en V de 96 pocillos (Nunc, 249662). Las células se lavaron con PBS frío antes de sembrar y se mantuvieron en hielo. Se prepararon diluciones en serie de proteína de perilla soluble recombinante en RPMI 1640 sin suero para dar un intervalo de concentración final de 0,00001 a 100 µg por 105 células. Se añadieron diluciones de proteína de perilla de fibra recombinante por triplicado a las células y se incubaron en hielo durante 30 min. La proteína del nudo de fibra no unida se eliminó lavando dos veces en PBS frío y se añadió anticuerpo primario CAR RmcB (Millipore, 05-644) o CD46 MEM-258 primario (Thermo Fisher Scientific, MA1-82140) para unir el receptor apropiado. El anticuerpo primario se eliminó después de 1 hora de incubación en hielo, y las células se lavaron dos veces más en PBS y se incubaron en hielo durante 30 min con anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A-11001). Los anticuerpos se diluyeron a una concentración de 2 µg / ml en PBS. Las células se lavaron y fijaron usando paraformaldehído al 4% y la tinción se detectó usando un citómetro BD Accuri C6 (BD Biosciences). El análisis se realizó utilizando FlowJo v10 (FlowJo, LLC) mediante el control secuencial de la población celular, singletes y células positivas para Alexa-488 en comparación con un control no teñido. La intensidad de fluorescencia total se determinó como la población unicelular positiva para Alexa-488 multiplicada por la intensidad de fluorescencia media y el IC Las células se lavaron y fijaron usando paraformaldehído al 4% y la tinción se detectó usando un citómetro BD Accuri C6 (BD Biosciences). El análisis se realizó utilizando FlowJo v10 (FlowJo, LLC) mediante el control secuencial de la población celular, singletes y células positivas para Alexa-488 en comparación con un control no teñido. La intensidad de fluorescencia total se determinó como la población unicelular positiva para Alexa-488 multiplicada por la intensidad de fluorescencia media y el IC Las células se lavaron y fijaron usando paraformaldehído al 4% y la tinción se detectó usando un citómetro BD Accuri C6 (BD Biosciences). El análisis se realizó utilizando FlowJo v10 (FlowJo, LLC) mediante el control secuencial de la población celular, singletes y células positivas para Alexa-488 en comparación con un control no teñido. La intensidad de fluorescencia total se determinó como la población unicelular positiva para Alexa-488 multiplicada por la intensidad de fluorescencia media y el IC50 curvas se ajustaron por regresión no lineal usando el software GraphPad Prism para determinar los IC 50 concentraciones.
Ensayos de unión a SPR
Para receptores de perilla de fibra
El análisis de unión se realizó usando un BIAcore T200 equipado con un chip sensor CM5. Aproximadamente 2000 unidades de respuesta (RU) de CAR, DSG2 y CD46 se conectaron al chip sensor CM5 mediante acoplamiento de amina, a un caudal lento de 10 μl / min. Se utilizó una celda de flujo en blanco como superficie de control negativo en la celda de flujo 1. Todas las mediciones se realizaron a 25 ° C en tampón PBS (MilliporeSigma, Reino Unido) con un 0,001% de tensioactivo P20 añadido (GE Healthcare) a 30 μl / min. Para el análisis de unión, se purificaron las proteínas de perilla de fibra HAdV-C5, HAdV-B35 y ChAdOX y se hicieron volar sobre la superficie de cada chip sensor a una concentración de 0,5 M para confirmar la unión. Para determinar la cinética de unión [on rate, k a (1 / ms); off rate, k d (1 / s)] y afinidad [ K D(nM)], se prepararon diluciones en serie 1: 2 para las proteínas de perilla de fibra HAdV-C5K, HAdV-B35K y ChAdOX y se inyectaron sobre CAR, DSG2 y CD46 inmovilizadas en la superficie de cada chip sensor. El K D y los valores cinéticos se calcularon asumiendo una relación 1: 1 de interacción con el software BIAevaluation.
Para interacciones PF4
Los ensayos se realizaron utilizando un BIAcore T200, Cytiva (anteriormente GE Healthcare). El tampón de inmovilización del ensayo fue HBS-EP + [HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,05% (v / v)]. Virus en ~ 1 × 10 11Se diluyó VP / ml 1: 5 en tampón acetato 4.5 y se inmovilizó en un chip sensor de C1 usando un protocolo de acoplamiento de amina estándar y un tiempo de inyección de muestra de 15 minutos. Normalmente, se inmovilizaron de 400 a 500 RU de virus. Se creó una superficie de sensor de referencia utilizando el mismo protocolo de acoplamiento de amina pero sin el virus. Las muestras se inyectaron con un tiempo de asociación de 60 a 120 sy un tiempo de disociación de 60 a 120 sa un caudal de 50 μl / min. La superficie se regeneró con una inyección de 30 s de NaOH 25 mM a un caudal de 50 µl / min. Todos los diagramas de sensorgram se restaron de la celda de flujo de referencia y de un ciclo de amortiguación para eliminar las respuestas inespecíficas, los cambios en el índice de refracción general y el ruido sistemático del instrumento.
Para los experimentos de gradiente de sal, la proteína PF4 (ChromaTec GmbH) se diluyó a 2000 nM en HBS-EP + con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% con varias concentraciones de NaCl para los experimentos de gradiente de NaCl. Para las mediciones de la afinidad de unión, se diluyó PF4 a 3000 nM en PBS y BSA al 0,5%. Se prepararon dos series de concentraciones independientes de PF4 usando diluciones 1: 3. Los datos de unión a PF4 se ajustaron utilizando el software de evaluación Biacore T200 utilizando el modelo de afinidad de estado estable.
Para las inyecciones de competición de heparina, se preparó PF4 hasta 2000 nM y se preparó heparina hasta 200.000 nM en PBS y BSA al 1%. Las muestras se prepararon como se describe: heparina sola (mezcla 1: 1 de stock de heparina y tampón), PF4 solo (mezcla 1: 1 de PF4 y tampón) y heparina y PF4 (mezcla 1: 1 de heparina y PF4 hasta un final relación molar de 100: 1).
Alineaciones de secuencia
Los alineamientos de secuencia se realizaron utilizando el algoritmo Clustal Omega implementado en Expasy ( 64 ).
Cálculos de superficies electrostáticas
El efecto electrostático de la faceta icosaédrica de ChAdOx1 en cualquier punto r = ( x , y , z ) de su entorno circundante se cuantifica por su potencial electrostático en r , que se denota como V ( r ). Este potencial V se determinó mediante el código Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS) ( 65 ). APBS calculó V utilizando la distribución de carga de ChAdOx1, la concentración de iones del entorno que rodea a ChAdOx1 y la permitividad del entorno. La V calculadapor lo tanto, se tuvo en cuenta la presencia de contraiones y la polarización del medio ambiente, que era la mayor parte de las moléculas de agua en nuestro estudio. Como el signo, + o -, de V ( r ) está altamente correlacionado con el número de cargas positivas o negativas alrededor de r , el potencial de PF4 también se calculó para visualizar la distribución de carga general de PF4 tras su unión a ChAdOx1. El modelo de partida para PF4 y PF4 en el complejo con fondaparinux fue PDB 1RHP y 4R9W, respectivamente.
Simulación BD de la faceta icosaédrica en solución con PF4
Las simulaciones de BD de múltiples réplicas se realizaron utilizando el código Atomic Resolution Brownian Dynamics (ARBD) ( 66 ). Durante las simulaciones, las copias de PF4 se trataron como cuerpos rígidos que se difunden en la vecindad de la faceta icosaédrica de ChAdOx1 en solución.
La ecuación de movimiento (EOM) obedecida por cada copia de PF4 para su difusión en simulaciones de BD es la dinámica de Langevin sobreamortiguada. Esta MOE requiere el conocimiento de las fuerzas del entorno sobre PF4 y sus coeficientes de amortiguación con el entorno. Estos coeficientes, coeficientes de amortiguamiento traslacional y coeficientes de amortiguamiento rotacional, se determinaron utilizando el código Hydropro ( 67 ).
Las fuerzas del entorno sobre el PF4 constaban de dos partes. La primera parte consistió en las fuerzas aleatorias de las fluctuaciones térmicas. Estas fuerzas aleatorias fueron generadas automáticamente por ARBD durante las simulaciones sobre la base de la temperatura del sistema T , que aquí es 310 K. La segunda parte consistió en la fuerza electrostática y la fuerza de van der Waals (VdW) sobre PF4 de la faceta icosaédrica. La fuerza electrostática en PF4 con su centro de masa en cualquier punto r fue calculada por ARBD automáticamente usando el potencial electrostático V de la faceta icosaédrica y las distribuciones de carga de PF4 alrededor r. De manera similar, especificamos la fuerza VdW entre la faceta icosaédrica y PF4 usando un potencial, el potencial de Lennard-Jones (LJ), denotado como U aquí. Este potencial U se calculó utilizando el código VMD ( 55 ). Los parámetros de LJ necesarios para este cálculo se adoptaron del campo de fuerza de Charmm36m ( 68 ).
Los diversos potenciales para la faceta icosaédrica y los coeficientes de amortiguación para PF4 se introdujeron en ARBD para simulaciones de BD multirreplica. Nuestro trabajo utilizó 16 réplicas de simulaciones en paralelo. Cada réplica duró un tiempo de simulación de 2 μs y simuló 25 copias de PF4 difundiéndose alrededor de la faceta icosaédrica. Durante las simulaciones, a estas 25 copias de PF4 solo se les permitió interactuar con la faceta icosaédrica y no interactuaron entre sí. Por lo tanto, juntos, realizamos 400 simulaciones de difusión independientes con PF4. Durante cada una de estas simulaciones, se permitió que PF4 se uniera o se desenlazara de la faceta icosaédrica. Es importante señalar que el tiempo de residencia para cada uno de estos eventos vinculantes suele ser de dos a tres órdenes de magnitudes diferentes en comparación con el tiempo de vinculación real. Esto se debe a que no se muestrean los cambios conformacionales posteriores a la unión de PF4, que a menudo estabilizan la interacción. Además, las simulaciones se realizan en un entorno de disolvente implícito, que se sabe que acelera la dinámica y la difusión de las proteínas, incluso en MD. La flexibilidad se simuló aplicando una distribución normal 3D con una SD de 2 Å en cada eje para cada átomo.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a AS Codd de la División de Vacunas y Enfermedades Infecciosas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson, Seattle, EE. UU.; S. Oh en el departamento de inmunología de Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona; y D. Goldblatt del University College London Great Ormand Street Children's Hospital, por sus importantes conocimientos sobre los mecanismos inmunológicos discutidos en este estudio y por la revisión del manuscrito. Nos gustaría agradecer a los miembros del consorcio de trombocitopenia trombótica del Reino Unido por sus útiles discusiones. También nos gustaría agradecer a DL Hurdiss, Departamento de Ciencias de la Salud Biomolecular, Universidad de Utrecht, Países Bajos; y S. Rawson, Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular, Escuela de Medicina de Harvard, para conversaciones críticas que conducen a una resolución mejorada del volumen crio-EM.
Fondos:Este trabajo utilizó el entorno de descubrimiento de ciencia e ingeniería extrema (XSEDE), que cuenta con el apoyo de la subvención de la Fundación Nacional de Ciencias ACI-1548562 (para AS). Este trabajo cuenta con el apoyo del Premio DP2 del Instituto Nacional de Salud CA195764 (a MJB); Premio K12 del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) CA090628 (a MJB); Premio CA234324 del Instituto Nacional de Salud K01 (a BMN); Premio de desarrollo profesional de Kathryn H. y Roger Penske, Mayo Clinic Cancer Center (para BMN); Fondos del Teletón sobre el Cáncer del quinto distrito de las Águilas 2020 para la investigación del cáncer, beca (para ATB); Beca de doctorado de Cancer Research Wales 514472 (para ALP); Beca de doctorado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff AC1170AP02 (para ALP); Premio del centro ECMC de Cancer Research UK C7838 / A25173 (a ALP); Apoyo al Programa de Terapéutica del Cáncer de Precisión del Centro de Medicina Individualizada (CIM) de Mayo Clinic (para MJB y ATB); Centro de Biodesign para Descubrimiento Estructural Aplicado en la Universidad Estatal de Arizona (para RJB y PF); Mayo Clinic Cancer Center (NCI 5P30CA015083) (para MJB y BMN); Tiempo de haz de la fuente de luz de diamante en DLS-I03 según la propuesta mx-20147 (a PJR); Subvención de NSF 1531991 para el apoyo a Titan Krios en el Centro de Materiales Eyring de ASU en la Universidad Estatal de Arizona (a DW); Centro de Computación de Liderazgo de Oak Ridge, con el apoyo de la Oficina de Ciencias, Departamento de Energía (DE-AC05-00OR22725) (para AS); fondos de puesta en marcha de SMS y CASD en la Universidad Estatal de Arizona (a AS); Premio NSF CAREER (MCB-1942763) (a AS); la subvención de la fundación Gordon y Betty Moore (a AS); la subvención de la fundación Mayo-ASU (a AS y MJB);
Contribuciones de los autores: Conceptualización: ATB, RJB, AS y ALP Metodología: ATB, RJB, AS, DS, CKC, AT-C., KS, ML-L., P.-LC, PJR, JWV, CDT, LC, y JVV Investigación: ATB, RJB, CKC, AT-C., DS, EB, JWV, EW, CDC, ML-L., DW, LM, MH y P.-LC Visualización: ATB, MH, LM y Adquisición de financiamiento de CKC: ATB, BMN, MJB, AS, ALP, SU, TSC, PF y PJR Administración del proyecto: ATB, AS, ALP y TSC Supervisión: ATB, BMN, MJB, TSC, SU, ALP, JVV, AS y PF Software: CKC, DS, AS y JVV Redacción (borrador original): ATB Redacción (revisión y edición): Todos los autores.
Conflicto de intereses: TSC, SU y LM son empleados y pueden tener acciones de AstraZeneca. AstraZeneca ha financiado estudios clínicos, no relacionados con este estudio, en la Clínica Mayo en los que MJB ha sido el investigador principal. Todos los demás autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Disponibilidad de datos y materiales: Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y / o en los Materiales complementarios. Las coordenadas y mapas de proteínas para la proteína y la cápside de la perilla de fibra ChAdOx1 se depositan en la wwPDB como 7OP2 y 7RD1, respectivamente. También se puede acceder a la información de la cápside ChAdOx1 en el EMDB como EMDB-24408. Las imágenes Cryo-EM y los archivos STAR de partículas seleccionadas se han depositado en el recurso de archivo de imágenes públicas de microscopía electrónica, EMPIAR-10754. AstraZeneca y la Universidad de Cardiff pueden proporcionar el vector AZD1222 y las proteínas de perilla de fibra de adenovirus recombinantes, respectivamente, en espera de una revisión científica y un acuerdo de transferencia de material completo. Las solicitudes de AZD1222 y proteínas de perilla de fibra recombinante deben enviarse al TSC y ALP, respectivamente.
Materiales complementarios
Este archivo PDF incluye:
Higos. S1 a S10
No hay comentarios:
Publicar un comentario